遺伝子分析データの精度管理と標準化のためのデータ解析環境：共有プラットフォーム（β版）

環境省環境研究総合推進費（課題番号S2-10）　クマ類の個体数推定法の開発に関する研究

１．遺伝マーカーの選択

２. マルチプレックスPCR用マーカーセットの事例

３．標準サンプルによる対立遺伝子サイズチェック

４．マイクロサテライトデータの精度管理

５．ソフトウェアリンク

６．参考論文

１．遺伝マーカーの選択

◆サンプルの分析に先立って，まず個体識別に使用する遺伝マーカー（遺伝子座）の選定を行う。個体識別効率を上げるために、調査対象個体群において多型性が高いマーカーを選択する必要がある。そのため、まず調査対象地域において採取された捕獲個体試料（40～50個体程度）を用いて，クマ類で報告されているマイクロサテライト遺伝子座（表１）からできるだけ多くの遺伝子座についてシングルPCRによる増幅を行い、フラグメント解析を行う。調査対象地域の捕獲個体試料が利用できない場合は，同じ個体群に属する近隣地域の試料を利用しても良い。

◆フラグメント解析の多型データから、Pid (Probability of Identity)を計算する。Pidを求めるためのソフトウェアとしてDROPOUT (McKelvey and Schwartz, 2005) が利用できる。Pid値が低い遺伝マーカーが個体識別用として適している。

表１　クマ類で利用されているマイクロサテライト遺伝子座

（Pid、対立遺伝子数、対立遺伝子サイズは、本推進費で調査した北上山地個体群における参考値を示す）

２．マルチプレックスPCR用マーカーセットの事例

◆分析費用・時間を減らすために、複数の遺伝マーカーを1チューブで同時増幅するマルチプレックスPCRを用いる。表２に本研究費で選定した多型性の高いマルチプレックスPCRセットを示した。それぞれの遺伝マーカーについて、遺伝子型を判別するための参考図となるピークパターン(事例）を示した。

表２　多型性が高いマーカーを組み合わせたマルチプレックスPCRセットおよび遺伝子型判別用参考図

３．標準サンプルによる対立遺伝子サイズチェック

◆マイクロサテライト遺伝子座の対立遺伝子サイズを確認するための標準DNAサンプル（ツキノワグマ8個体のDNA）を分与します。自治体等の試験研究機関および大学等において業務としてヘアトラップ調査を実施する担当者で、標準DNAサンプルの分与を希望する方は、下記にご連絡ください。標準DNAサンプルには対立遺伝子サイズデータが付属しており、分析後にデータ合わせをすることにより、正しく分析が行われていることを確認できます。

　送付元：　住所：990-8560　山形市小白川町１－４－１２　山形大学　理学部　玉手研究室
　　　　　　　電話：023-628-4620　ファックス：023-628-4620　e-mail: tamate*sci,kj.yamagata-u.ac.jp （*はアットマーク）
　申し込み手続き：　財団法人自然環境研究センター（担当者XXXX）にご連絡ください。URL:

4．マイクロサテライトデータの精度管理

◆誤判別率を推定する方法：PEDANT
　ヘアトラップで用いる微量DNA分析では、遺伝子型を誤って判別するallelic dropoutやfalse alleleが起こる可能性がある。
allelic dropoutは、正しくはヘテロ（AB）である遺伝子型を、誤ってホモ（AA)と判別するエラー
false alleleは、正しくはABである遺伝子型をACのように、対立遺伝子の種類を間違って判別するエラー
　Johnson & Haydon (2007)は、このようなエラーがどれくらい生じるのかを推定する方法を提案している。この方法では、少なくとも2回繰り返してPCRと遺伝子型の判定を行い、。最初と二回目（もしくは最終的に決定した遺伝子型）の値が異なれば、そこではエラーが生じていたと考える。
誤判別率を最尤推定するためのプログラムPEDANTは　http://www.stats.gla.ac.uk/~paulj/index.html　からダウンロードできる。

参考文献　Johnson PCD, Haydon DT (2007). Maximum likelihood estimation of allelic dropout and false allele error rates from microsatellite genotypes in the absence of reference data. Genetics 175 (2): 827-842.

◆適合度検定によりホモ過剰個体を検出する方法：GOF calculator
　あらかじめ、筋肉サンプル等の分析で調査対象個体群の遺伝子頻度が調べられている場合には、適合度検定を行うことによって、ホモ個体数を過剰に見積もっていないかを確かめることができる。この適合度検定では、調査対象個体群の遺伝子頻度から推定したホモ個体の出現頻度と、実際の観察値を比較する。適合度検定を行うためのExcelテンプレートGOF calculatorは　URL　からダウンロードできる。

５．マイクロサテライト解析のためのソフトウェアリンク

GENECAP
　機能：DNAサンプルの遺伝子型を相互に照合して、同一遺伝子型のサンプルをソートし、ミスマッチの組み合わせをリスト化するプログラム。
　文献：Wilberg MJ and Dreher BP (2004) GENECAP: a program for analysis of nuclear data for capture-recapture population estimation. Molecular Ecology Notes 4: 783-785.

MICROCHECKER
　機能：マイクロサテライトデータの遺伝子頻度を計算して、ヌルアリル等を検出するプログラム。
　文献：

DROPOUT
　機能：対立遺伝子が選択的に増幅・非増幅されるエラー（ドロップアウト）を検出するプログラム。
　文献：McKelvey K, Schwartz MK (2005) DROPOUT: a program to identify problem loci and samples for noninvasive genetic samples in a capture-mark-recapture framework. Molecular Ecology Notes 5:716-718.

GENEPOP
　機能：ヘテロ接合度や対立遺伝子頻度の計算、ハーディワインベルグ平衡からの逸脱の検定等を行うプログラム。
　文献：Raymond, M. & Rousset, F., 1995b. GENEPOP Version 1.2: population genetics
software for exact tests and ecumenicism. J. Hered. 86: 248-249.

FSTAT
　機能：ヘテロ接合度や対立遺伝子頻度の計算等を行うプログラム。
　文献：Goudet, J., 1995. FSTAT (Version 1.2): A computer program to calculate Fstatistics. J. Hered. 86: 485-486.

MICROSATELLITE TOOL KIT
　機能：マイクロサテライトデータの遺伝子頻度を計算して、ヌルアリル等を検出する表計算ソフトのアドイン
　文献：www.fs.fed.us/rm/wildlife/genetics/

その他のソフトウェアs
1. GIMLET
2. COMBI.PL
HELGE TÄUBERT and DANIEL G. BRADLEY. Molecular Ecology Resources (2008) 8, 572–574. COMBI.PL: a computer program to combine data sets with inconsistent microsatellite marker allele size information.
3. MARK
www.cnr.colostate.edu/~gwhite/mark/mark.htm
4. M-SURGE
ftp://ftp.cefe.cnrs-mop.fr/biom/Spft-CR/
5. POPAN
www.cs.umanitoba.ca/~popan/
6. PRESENCE
www.mbr-pwrc.usgs.gov/software.html
Analysis Software Forum: www.phidot.org/forum
7. DENSITY
Efford M, Dawson DK, Robbins CS (2004) DENSITY: software for analyzing capture-recapture data from passive detector arrays. Animal Biodiversity and Conservation 27: 217-228.

６．参考文献

遺伝子型の誤判定に関する論文
1. Knapp SM, Craig BA, Waits LP (2009) Incorporating genotyping error into non-invasive DNA-based mark-recapture population estimates. J. Wildlife Management 73: 598-604.
2. Zhan X, Zheng X, Bruford MW, Wei F, Tao Y (2009) A new method for quantifying genotyping errors for noninvasive genetic studies. Conservation Genetics.
3. Dreher BP, Winterstein SR, Scribner KT, Lukacs PM, Etter DR, Rosa GJM, Lopez VA, Libants S, Filcek KB　(2007) Noninvasice estimation of black bear abundance incorporating genotyping errors and harvested bear. J Wildlife Management 71: 2684-2693.
4. Valiere N, Bonenfant C, Toigo C, Luikart G, Gaillard JM, Klein F (2007) Importance of a pilot study for non-invasice genetic sampling: genotyping errors and population size estimation in red deer. Conservation Genetics 8: 69-78.
5. Roon DA, Waits LP, Kendall KC (2005) A simulation test of the effectiveness of several methods for error-checking non-invasive genetic data. Animal Conservation 8: 203-215. Error Filter
6. Schwartz MK, Cushman SA, McKelvey K, Hayden J, Engkjer C (2006) Detecting genotyping errors and describing American black bear movement in northern Idaho. Ursus 17: 138-148.
7. McKelvey K, Schwartz MK (2004) Providing reliable and accurate genetic mark-recapture in a cost-effective manner. J Wildlife Management 68: 453-456.
8. McKelvey K, Schwartz MK (2004) Dangers of genetic errors in mark-recapture sampling: problems and new solutions. J Wildlife Management 68: 439-448.

使用する遺伝マーカーの数の検討
1. Paetkau D (2004) The optimal number of markers in genetic capture-mark-recapture studies. J Wildlife Management 68: 449-452.

総説
1. Dewoody J, Nason JD, Hipkins VD (2006) Mitigating scoring errors in microsatellite data from wild populations. Molecular Ecology Notes 6: 951-957.
2. Lukacs PM, Burnham KP (2005) Review of capture-recapture methods applicable to noninvasive genetic sampling. Molecular Ecology 14: 3909-3919.

性判別
1. Pages M, Maudet C, Bellemain E, Taberlet P, Hughes S, Hanni C (2009) A system for sex determination from degraded DNA: a useful tool for palaeogenetics and conservation genetics of ursids. Conservation Genetics 10: 897-907.

効率のよいPCR手法（Two-step PCR）
1. Arandjelovic M, Guschanski K, Schubert G, Harris R, Thalmann O, Siedel H, Vigilant L (2009) Two-step multiplex polymerase chain reaction improves the speed and accuracy of genotyping using DNA from noninvasive and museum samples. Molecular Ecology Resources 9: 28-36.

プライマー情報
1. Brownstein M, Carpten J, Smith J (1996) Modulation of nontemplated nucleotide addition of Taq DNA polymerase: primer modifications that facilitate genotyping. BioTechniques 20: 1004-1010.
Microsatellite markers
1. Itoh T, Sato Y, Mano T, Iwata R (2009) Estimating a suitable microsatellite marker set for individual identification and parentage tests of brown bear (Ursus arctos) in the Akan-Shiranuka region, eastern Hokkaido, Japan. J. Forest Research 14: 117-122.
G and UarMU series
2. Sanderlin JS, Faircloth BC, Shamblin B, Conroy MJ (2009) Tetranucleotide microsatellite loci from the black bear (Ursus americanus). Molecular Ecology Resources 9: 288-291.
3. Shih CC, Huang CC, Li SH, Hwang MH, Lee LL (2009) Ten novel tetranucleotide microsatellite DNA markers from Asiatic black bear, Ursus thibetanus. Conservation Genetics